《刺客信条1》的剧情设定在12世纪末的欧洲，主要围绕刺客Altair展开。在游戏中，玩家将扮演这位身手不凡的白衣刺客，为了结束帮派斗争而进行一系列暗杀任务。故事背景穿梭于大马士革、耶路撒冷等中东历史名城之间，当时的统治者以高压方式统治人民，诛杀异己，百姓苦不堪言。玩家所扮演的刺客阿泰尔，以来无影去无踪的高超杀人技巧，专门刺杀残暴的统治阶层，而铲奸除恶也成为玩家信守的“刺客信条”，为救无辜百姓而努力。
然而，在《刺客信条1》的续作中，剧情发生了变化。主角不再是阿泰尔，而是一个叫戴斯蒙德·迈尔斯的酒吧服务生。戴斯蒙德的祖先正是阿泰尔，而邪恶的Abstergo公司试图通过基因记忆提取技术，找到古代神器伊甸园碎片的下落。戴斯蒙德被绑架并被迫回忆祖先的记忆，而游戏的内容则通过戴斯蒙德的梦境展现，这些梦境实际上是他祖先阿泰尔的记忆片段。
古代圣堂骑士和刺客部落的争斗一直延续至今，戴斯蒙德作为刺客后代的一员，被Abstergo公司绑架并逼迫其回忆祖先的记忆。Abstergo公司由圣堂骑士的后代组成，他们试图通过控制人类的意识和杀掉那些不被他们能力影响的人，以达到让世界得到和平的目的。游戏中，戴斯蒙德需要逐步揭开隐藏在古代记忆中的秘密，并阻止Abstergo公司的邪恶计划。
