《猫和老鼠》中的主要人物包括：
汤姆 （猫）：一只灰色家猫，总是闪着机会主义的光芒，弓着腰在一旁等待机会出击杰瑞。汤姆总想抓住与它同居一室却难以抓住的老鼠杰瑞，但总是遭到失败。尽管如此，它在追逐中的乐趣远远超过了抓住杰瑞，甚至偶尔抓住了杰瑞后也不知道怎么处理，他们在不知不觉中已经成为对方生活中不可或缺的一个角色。杰瑞
（鼠）：一只聪明机智的灰色小老鼠，总是用挑逗的眼神看着镜头，并且常常在不经意期间玩弄汤姆。杰瑞古灵精怪，经常能成功的戏弄汤姆且让他糗事百出，不过有时他也会被汤姆戏弄。在戏弄汤姆的同时，杰瑞也会享受到汤姆对它的关心，让它感动。
两只鞋太太（人）：动画中汤姆猫的几种不同主人中最常出现的一位，经常处理两位主角在自己家中所制造的麻烦。由于视角问题，镜头只能看到她腰以下的部位。在动画中的设定大约40岁左右，身材粗壮的大妈形象。1952年之后不再登场。
泰菲（鼠）：一个由杰瑞收养的小灰鼠弃儿，个体娇小可爱，通常穿白色尿布，非常贪吃，会讲法语，无时无刻不在卖萌。
布奇（猫）：一只肮脏的流浪猫，总想捉到杰瑞，因此有时会与汤姆合作，但更多时候却与汤姆为敌（大多是成为情敌）。登场的时候经常唱的歌曲是绿野仙踪的插曲《在彩虹上》。
斯派克（狗）：一只凶猛的斗牛犬，不管是汤姆有意拿他寻开心、还是捉杰瑞时不小心的、或者是杰瑞栽赃嫁祸的，汤姆总能招惹到他，因此总是被它暴打一顿。
佩克斯·佩斯特：
一只灰色的老鼠，带着牛仔帽、穿马靴、留了两簇浓密白胡子。佩克斯带着心爱的吉他来到杰瑞的住处看电视，并作短暂停留。佩克斯进入房间，自顾自地为杰瑞弹唱起来。谁知唱到高潮处时，琴弦突然断掉。佩克斯竟然走进房间，从正在睡觉的汤姆脸上揪了一根胡子下来当琴弦。
莱特宁：
首次登场时是与汤姆争宠为背景的，移动速度如同闪电，后来成为由布奇领导的“流浪猫铁三角”的一员，同时失去了闪电移动的能力。
托普斯：
流浪猫铁三角的成员之一，身材矮小，比较喜欢搞怪。
米特：
一只棕色的流浪猫，原为流浪猫铁三角的一员头上有一撮红色的毛发。
多菲：
猫鼠少儿版的角色，也是猫鼠版权被华纳拿走之后加入进来的。
梅林：
杰瑞的表哥之一，是一个充满气场，温文尔雅，并时刻保持绅士风格的魔术师，以自己强大的魔法把汤姆耍得团团转。
马索尔：
一个伤害、控制和救援能力都不错的角色，在有怒气时，可以对猫咪造成极大的干扰，前期可以救援，后期可以破墙，对团队能起到极大的作用。
拿坡里：
一只来自意大利的小老鼠，拥有通体灰色的皮肤，俏皮的耳朵高高竖起在一众老鼠中是独一无二的，常常穿着一件绿色的上衣显得格外活泼。
泰克：
斯派克的儿子，经常因汤姆和杰瑞的打闹而无辜地受牵连，是斯派克爆打汤姆的主要原因之一。
这些角色在《猫和老鼠》的动画中各有特色，共同构成了这部经典动画的丰富故事线。
